如何比较磷酸化蛋白表达量：基因蛋白磷酸化以后会影响其转录水平么

一、基因蛋白磷酸化以后会影响其转录水平么

基因蛋白磷酸化以后会影响其转录水平.转录没有变化，说明mRNA的转录没有收到影响，但是protein level降低是有几种原因，可能是蛋白降解了：（1）proteasome依赖的途径，即蛋白酶体介导的蛋白降解；
可用proteasome抑制剂如MG132或bortezomib，看是否影响蛋白水平。
（2）溶酶体介导的降解，很多时候与autophagy（自噬）有关，可以用溶酶体抑制剂chloroquine或自噬抑制剂bafilomycin A1，看蛋白水平变化。
同时，为了研究蛋白的水平变化，也用Cycloheximide（CHX，放线菌酮）来抑制蛋白合成。
 蛋白水平是个动态过程，就如水池中的水量是由水龙头的水流量（可认为是蛋白的合成）和下水道的流出量（可以认为是蛋白的降解）决定的

二、Western Blot为什么必须要用内参

内参作为一个参考物选用一个表达量相对稳定的蛋白，如actin，GAPDH等。
不同方法处理细胞时内参的表达量不变，目的蛋白有可能会有变化。
western中各泳道的内参的条带一样，那说明蛋白浓度一样。
总蛋白浓度一样，目的蛋白条带宽度差异才能体现出目的蛋白表达量的差别。

三、293T细胞为什么经常用于转染，蛋白质表达

好养。
但是蛋白质表达更常用的应该是cho。
293t也就看看表达量怎么样。

四、生物选修3 基因工程

目的基因导入受细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只通过检测与鉴定才能知道。
在检测与鉴定时我认为有以下五种检测鉴定： 1、 检测受体细胞中的标记基因是否表达，即是否表现出标记基因的性状，从而判断受体细胞中是否已导入含有目的基因的运载体。
如果检测出标记基因表达的性状，说明运载体已导入受体细胞。
 2、 检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因，这是目的基因能否在真核生物中稳定遗传的关键。
 检测方法是：采用DNA分子杂交技术。
先将转基因生物的基因组提取出来；
把目的基因的DNA片段用放射性同位素作标记做成探针；
使探针与基因组DNA杂交，如果出现杂交带，就表明目的基因已插入染色体DNA中。
 3、 检测目的基因是否转录出了mRNA，这是检测目的基因是否发挥功能作用的第一步。
采用DNA与RNA分子杂交技术。
从转基因生物中提取出mRNA，把目的基因的DNA片段用放射性同位素作标记做成探针；
使探针与mRNA杂交，如果出现杂交带，就表明目的基因转录出了mRNA。
 4、 检测目的基因是否翻译成蛋白质。
从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体（对抗进行同位素标记）进行抗原——抗体杂交；
如果出现杂交带，表明目的基因已形成蛋白质产品。
 5、 个体生物学水平的鉴定。
如：一个抗虫或抗病的目的基因导入植物细胞后，是否具有了抗虫或抗病特性，需要做抗虫或抗病的接种实验，观察害虫的存活情况或植物的患病情况以确定是否具有抗性及抗性的程度。
又如：有的基因工程产品需要与天然产品的功能进行活性比较，以确定转基因产品的功能中否与天然产品相同，甚至超过天然产品。
 抗原抗体杂交利用抗体特异性 Western杂交——蛋白质分子（抗原—抗体）之间的杂交。
它是检测目的基因是否表达出蛋白质的一种方法。
  具体做法是：  第一步，将目的基因在大肠杆菌中表达出蛋白质；
  第二步，将表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出抗体（一抗）；
  第三步，从转基因生物中提取蛋白质，走凝胶电泳；
  第四步，将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素膜上；
  第五步，将抗体（一抗）与硝酸纤维素膜上的蛋白杂交，这时抗体（一抗）与目的基因表达的蛋白（抗原）会特异结合。
  由于这种抗原—抗体的结合显示不出条带，所以加入一种称为二抗的抗体，它可以与一抗结合，二抗抗体上带有特殊的标记。
如果目的基因表达出了蛋白质，则结果为阳性。

五、生物生物！蛋白质磷酸化问题

感觉是不是激活特异的酶就可以是某些位点特异性磷酸化作用增强啊…后边用免疫印迹检测就行了…

六、如何证明某蛋白质是否在氧化磷酸化中起重要作用

实验证明那个蛋白是在细胞质中还是细胞核中起作用细胞内以及细胞间传递信息的物质都是蛋白质是不对的细胞内以及细胞间传递信息的物质可以是酚类衍生物如肾上腺素、甲状腺素等，也可以是类固醇化合物如性激素等。
这些都不是蛋白质所以细胞内以及细胞间传递信息的物质都是蛋白质是不对的直径小于10nm的小分子可以通过被动扩散进入，大分子如核糖体蛋白需要主动转运进入，也有的小分子蛋白质因为带有信号序列所以也是主动运输进去的，如AE。
参考资料见下文：核孔复合体可以看作一种特殊的跨膜运输蛋白复合体，并且是一个双功能、双向性的亲水性核质交换通道。
双功能表现在它有两种运输方式：被动扩散和主动运输。
双向性表现在既介导蛋白质的入核转运，又介导RNA、核糖核蛋白颗粒(RNP)的出核转运。
1、通过核孔复合体的被动扩散：核孔复合体作为被动扩散的亲水通道，其有效直径为9~10nm，有的可达12.5nm，即离子、小分子、以及直径在10nm以下的物质原则上都可以自由通过。
有些蛋白质相对分子量虽小，但带有特殊的氨基酸信号序列，因此是通过主动运输运进核内的；
或者本身没有信号序列，但可以与其他具信号序列的物质结合，一起可通过主动运输进入核内。
所以，核孔复合体的被动扩散并不意味着所有直径小于10nm的小分子在核膜两侧的分布都是均匀的。
2、主动运输：生物大分子的核质分配如亲核蛋白的核输入、RNA分子及RNP颗粒的核输出主要是通过核孔复合体的主动运输完成的。
其运输具有选择性及双向性。
其选择性表现在以下方面：（1）对运输颗粒大小的限制，其功能直径比被动扩散大，约10-20nm，甚至可达26nm。
比如象核糖体亚单位这样大的颗粒也可以通过核孔复合体到细胞质中。
（2）通过核孔复合体的主动运输是一个信号识别与载体介导的过程，需消耗ATP的能量。
（3）具双向性。
即可把DNA聚合酶、RNA聚合酶、组蛋白（B）、核糖体蛋白（C）等运进核内，又可把mRNA、装配好的核糖体亚单位等从核内运到细胞质。
D为什么不对：延伸因子是在mRNA翻译时促进多肽链延伸的蛋白质因子，在细胞质中。
它不用进去。

参考文档